Spektrofotometrija je eksperimentalna tehnika koja se koristi za mjerenje koncentracije otopljene tvari u određenoj otopini izračunavanjem količine svjetlosti koju ta tvar apsorbira. Ova tehnika je vrlo korisna jer će određeni spojevi apsorbirati različite valne duljine svjetlosti različitog intenziteta. Analizom svjetlosti koja prolazi kroz otopinu možete identificirati spojeve otopljene u otopini i njihove koncentracije. Alat za analizu otopina s ovom tehnikom u laboratoriji je spektrofotometar.
Korak
1. dio od 3: Priprema uzorka
Korak 1. Uključite spektrofotometar
Većinu spektrofotometara potrebno je zagrijati prije nego što mogu dati točna mjerenja. Dakle, pokrenite stroj i ostavite ga da odstoji najmanje 15 minuta prije mjerenja uzorka.
Iskoristite ovo vrijeme za pripremu uzorka
Korak 2. Očistite kivetu ili epruvetu
U školskim laboratorijima mogu biti dostupne epruvete za jednokratnu upotrebu koje se ne moraju prethodno očistiti. Međutim, ako koristite običnu kivetu ili epruvetu, prije upotrebe pažljivo očistite aparat. Isperite sve kivete deioniziranom vodom.
- Budite oprezni pri upotrebi kiveta jer su prilično skupe.
- Dok koristite kivetu, ne dodirujte stranu na kojoj prolazi svjetlost (obično čista strana posude).
Korak 3. Ulijte dovoljno uzorka u kivetu
Maksimalna zapremina dijela kivete je 1 ml, dok je maksimalna zapremina epruvete 5 ml. Vaša mjerenja trebaju biti točna sve dok svjetlost spektrofotometra još uvijek može proći kroz uzorak, a ne kroz prazan dio spremnika.
Ako koristite pipetu za umetanje uzoraka, upotrijebite novi vrh za svaki uzorak. Na taj način se može izbjeći unakrsna kontaminacija
Korak 4. Pripremite kontrolnu otopinu
Ovi rastvori koji su poznati i kao slijepi ili slijepi proizvodi sadrže samo otapalo u otopini koja se analizira. Na primjer, ako imate uzorak soli otopljen u vodi, slijepa otopina vam je potrebna voda. Ako je voda koju koristite crvena, upotrijebite i crveni blank rastvor. Koristite sličnu posudu za držanje slijepe otopine u istoj količini kao i uzorak.
Korak 5. Obrišite spoljašnju stranu kivete
Prije nego umetnete kivetu u spektrofotometar, morate osigurati da je čista kako biste izbjegli smetnje u mjerenjima zbog čestica prašine ili nečistoća. Krpom koja ne ostavlja dlačice uklonite sve kapljice vode ili prašinu koja se slijepila s vanjske strane kivete.
Dio 2 od 3: Eksperimentiranje
Korak 1. Odredite i podesite talasnu dužinu svjetlosti za analizu uzorka
Koristite jednu valnu dužinu svjetlosti (jednobojni snop) kako biste povećali efikasnost mjerenja. Odaberite boju svjetlosti koju može apsorbirati kemijski sadržaj za koji se smatra da je otopljen u uzorku za ispitivanje. Postavite valnu duljinu prema specifikacijama spektrofotometra koji koristite.
- U školskim laboratorijima ove valne duljine obično će biti navedene u eksperimentalnim uputama.
- Budući da će uzorak reflektirati svu vidljivu svjetlost, valna duljina boje eksperimentalne svjetlosti obično se uvijek razlikuje od boje uzorka.
- Objekt izgleda određene boje jer odražava određenu valnu duljinu i upija sve ostale boje. Trava izgleda zeleno jer klorofil u njoj reflektira zelenu boju i upija druge boje.
Korak 2. Kalibrirajte spektrofotometar sa slijepom otopinom
Stavite praznu otopinu u držač kivete i zatvorite spektrofotometar. Na ekranu analognog spektrofotometra nalazi se igla koja će se pomicati na osnovu intenziteta detekcije svjetlosti. Nakon što se ubaci prazna otopina, igla bi se trebala pomaknuti udesno. Zapišite ovu vrijednost u slučaju da vam kasnije zatreba. Ostavite slijepu otopinu da ostane u spektrofotometru, a zatim pomaknite iglu na nulu pomoću dugmeta za podešavanje.
- Digitalni spektrofotometri također se mogu kalibrirati na isti način. Međutim, ovaj alat je opremljen digitalnim ekranom. Očitavanje slijepe otopine postavite na 0 pomoću upravljačkog dugmeta.
- Čak i ako se slijepa otopina ukloni iz spektrofotometra, kalibracija će i dalje biti važeća. Dakle, kada izmjerite cijeli uzorak, apsorpcija slijepe probe će se automatski smanjiti.
Korak 3. Uklonite slijepu probu i testirajte rezultate kalibracije spektrofotometra
Čak i nakon što se slijepa otopina ukloni iz spektrofotometra, igla ili broj na ekranu i dalje bi trebali biti 0. Vratite slijepu otopinu u spektrofotometar i pazite da se očitanja ne promijene. Ako je spektrofotometar pravilno kalibriran pomoću slijepe otopine, rezultat na ekranu bi i dalje trebao biti 0.
- Ako igla ili broj na ekranu ne očitavaju 0, ponovite korake kalibracije s praznom otopinom.
- Ako problem potraje, potražite pomoć ili neka netko provjeri spektrofotometar.
Korak 4. Izmjerite apsorbanciju uzorka
Uklonite slijepu otopinu i umetnite uzorak u spektrofotometar. Pričekajte oko 10 sekundi da se kazaljke stabilizuju ili se brojke na digitalnom ekranu prestanu mijenjati. Zabilježite postotak propusnosti i/ili apsorbancije uzorka.
- Što se više svetlosti prođe, manje se svetlosti apsorbuje. Obično morate zabilježiti vrijednost apsorbancije uzorka koja se općenito izražava kao decimalni broj, na primjer 0,43.
- Ponovite mjerenje svakog uzorka najmanje tri puta, a zatim izračunajte prosjek. Na taj način će rezultati koje dobijete biti točniji.
Korak 5. Ponovite eksperiment sa različitim talasnim dužinama svjetlosti
Vaš uzorak može sadržavati nekoliko spojeva koji imaju različitu apsorpciju ovisno o valnoj duljini svjetlosti. Da biste smanjili nesigurnost, ponovite mjerenje uzorka u intervalima od 25 nm talasne dužine u cijelom svjetlosnom spektru. Na ovaj način možete otkriti druge otopljene kemikalije u uzorku.
Dio 3 od 3: Analiza podataka o apsorpciji
Korak 1. Izračunajte propusnost i apsorbanciju uzorka
Propusnost je koliko svjetlosti može proći kroz uzorak i doći do spektrofotometra. U međuvremenu, apsorpcija je količina svjetlosti koju apsorbira jedna od otopljenih kemikalija u uzorku. Postoji mnogo modernih spektrofotometara koji daju izlaz u obliku propusnosti i apsorbancije. Međutim, ako dobijete vrijednost intenziteta svjetlosti, ove dvije vrijednosti možete i sami izračunati.
- Propusnost (T) može se odrediti dijeljenjem intenziteta svjetlosti koja prolazi kroz otopinu uzorka s količinom svjetlosti koja prolazi kroz slijepu otopinu. Ova vrijednost se obično izražava kao decimalni broj ili postotak. T = I/I0, gdje je I intenzitet uzorka i I0 je intenzitet slijepe probe.
- Apsorbancija (A) se izražava kao negativna baza 10 logaritamska (eksponentna) propusnost: A = -log10T. Dakle, ako je T = 0, 1, A = 1 (0, 1 je 10 na stupanj -1). To znači da 10% svjetlosti prođe, dok se 90% apsorbira. U međuvremenu, ako je T = 0,01, A = 2 (0,01 je 10 na stepen -2). To znači da je propušteno svjetlo 0,1%.
Korak 2. Iscrtajte vrijednost apsorbancije u odnosu na valnu dužinu
Izrazite vrijednost apsorbancije kao y-os, a valnu duljinu kao x-os. Od točaka svih rezultata apsorpcije na svakoj valnoj duljini dobit ćete spektar apsorbancije uzorka i identificirati sadržaj spoja i njegov omjer u uzorku.
Spektri apsorbancije obično imaju vrhove na određenim valnim duljinama. Ove vršne valne duljine omogućuju vam identifikaciju specifičnih spojeva
Korak 3. Uporedite svoj spektar apsorbancije sa grafikonom poznatog jedinjenja
Svaki spoj ima jedinstveni spektar apsorbancije i uvijek ima istu vršnu valnu duljinu pri svakom mjerenju. Uspoređujući grafikon koji dobijete s grafikonom određenog poznatog spoja, možete identificirati sadržaj otopljene tvari u otopini uzorka.
