Bojanje po Gramu je brza tehnika i koristi se za provjeru prisutnosti bakterija u uzorku tkiva i za klasifikaciju bakterija kao gram-pozitivnih ili gram-negativnih, na temelju kemijskih i fizičkih svojstava njihovih staničnih stijenki. Mrlja po Gramu se gotovo uvijek koristi kao prvi korak u dijagnosticiranju bakterijske infekcije.
Ova tehnika bojenja dobila je ime po danskom naučniku Hansu Christian Gramu (1853 - 1938), koji je tehniku razvio 1882. godine i objavio je 1884. godine kao tehniku za razlikovanje dvije vrste bakterija sa sličnim kliničkim simptomima: Streptococcus pneumoniae (poznata i kao Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) i bakterija Klebsiella pneumoniae.
Korak
Metoda 1 od 3: Priprema stakalca za mikroskop
Korak 1. Pripremite se za rad u laboratoriji
Nosite rukavice i dugu kravatu za kosu kako biste spriječili bakterijsku kontaminaciju uzorka koji testirate. Očistite radni prostor ispod haube ili u drugom dobro provetrenom prostoru. Prije početka provjerite Bunsenov plamenik i uvjerite se da mikroskop radi ispravno.
Korak 2. Sterilizirajte stakleno staklo mikroskopa
Ako je stakleno staklo prljavo, operite ga vodom sa sapunom kako biste uklonili ulje i prljavštinu. Očistite stakalca etanolom, sredstvom za čišćenje stakla ili drugom metodom koju koristi vaša laboratorija.
Korak 3. Stavite uzorak na staklo
Tehniku bojenja po Gramu možete upotrijebiti za identifikaciju bakterija u medicinskom uzorku ili kulturu bakterija koja raste u petrijevoj zdjelici. Za najbolje rezultate, koristite Gramovu mrlju na tankim potezima uzorka. Preporučljivo je koristiti uzorke stare manje od 24 sata, jer su starije bakterije mogle oštetiti ćelijske stijenke i možda neće reagirati na bojenje po Gramu.
- Ako koristite uzorak tkiva, dodajte 1-2 kapi na stakleno staklo. Ravnomjerno rasporedite po stakalcu kako biste formirali tanak sloj prskanja uzorka klizanjem po rubu drugog sterilnog stakalca. Pustite da se osuši prije nego što napravite sljedeći korak.
- Ako uzimate bakterije iz Petrijeve zdjelice, sterilizirajte petlju za cijepljenje u Bunsenovom plameniku dok ne zasvijetli, a zatim je ostavite da se ohladi. Upotrijebite petlju kako biste nakapali sterilnu vodu na stakalce, a zatim je sterilizirajte i ponovo ohladite prije nego što je upotrebite za prikupljanje malog uzorka bakterija. Nakon toga lagano promiješajte.
- Bakterije pripremljene u bujonu moraju se ponovo promiješati pomoću vrtložnjaka, zatim uzeti s inokulacijskom petljom kao gore, bez dodavanja vode.
- Ako imate uzorak brisa (obično se radi s malom ručkom s vrhom pamuka), dodirnite i lagano zakrenite bris po pločici.
Korak 4. Malo visoka temperatura može dobro razmazati
Toplina će zadržati bakterije na vrhu stakalca, tako da se one ne otapaju lako tijekom procesa bojenja. Brzo dodirnite klizač dva do tri puta po Bunsenovom plameniku ili zagrijte klizač preko električnog grijača. Nemojte se pregrijavati, uzorak se može oštetiti. Ako koristite Bunsenov plamenik, to bi trebao biti mali, ali plavi plamen, umjesto velikog narančastog plamena.
Alternativno, razmaz se može napraviti i s metanolom, dodavanjem 1-2 kapi metanola u suhi bris, sušenjem preostalog metanola na stakalcu, ostavljanjem na otvorenom. Ova tehnika smanjuje oštećenje ćelija i pruža čistu pozadinu slike slajda
Korak 5. Postavite klizač preko ladice za bojenje
Posude za bojenje izrađene su od metala, stakla ili plitkih plastičnih ploča sa mekanom mrežicom na vrhu. Postavite dijapozitive na ove mreže, tako da se tekućina koju koristite može ispustiti u ladicu.
Ako nemate ladicu za bojanje, možete postaviti slajd na plastičnu ladicu za ispis kockica leda
Metoda 2 od 3: Postupak bojenja po Gramu
Korak 1. Sipajte kristalno ljubičastu tekućinu preko razmaza
Pipetom poprskajte uzorak bakterije s nekoliko kapi kristalno ljubičaste boje, poznate i kao encijan ljubičica. Ostavite 30-60 sekundi. Kristalna ljubičica (KV) se u vodenoj otopini odvaja na KV+ i kloridne (Cl-) ione. Ovi ioni prodiru u stanične stijenke i stanične membrane i gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija. KV+ ion stupa u interakciju s negativno nabijenim komponentama bakterijskih stanica, dajući stanicama ljubičastu boju.
Mnogi laboratoriji koriste kristalno ljubičastu boju "Hucker" koja sadrži amonijev oksalat za sprječavanje taloženja
Korak 2. Lagano isperite kristalno ljubičastu boju
Nagnite klizač i upotrijebite bocu za ispiranje kako biste prskali mali mlaz destilirane vode ili vode iz slavine preko stakalca. Voda bi se trebala slijevati po površini razmaza i ne smije se prskati direktno po razmazu. Ne ispirati previše. Može ukloniti mrlje kod gram pozitivnih bakterija.
Korak 3. Isperite razmaz jodom, zatim isperite
Kapaljkom isperite razmaz jodom. Ostavite da djeluje najmanje 60 sekundi, a zatim pažljivo isperite na isti način kao što je gore navedeno. Jod, u obliku negativno nabijenog iona, stupa u interakciju s KV+ stvarajući veliki kompleks spojeva između kristalno ljubičaste i joda (kompleks jedinjenja CV-I) u unutrašnjem i vanjskom sloju ćelije. Ovaj kompleks spojeva zadržat će ljubičastu boju kristalno ljubičaste unutar ćelije, na umrljanim mjestima.
Jod je korozivna tvar. Izbjegavajte udisanje, gutanje ili kontakt sa kožom
Korak 4. Dodajte izbjeljivač u boji, a zatim brzo isperite
Za ovaj važan korak obično se koristi mješavina acetona i etanola u omjeru 1: 1, koju je potrebno pažljivo rasporediti. Postavite tobogan pod određenim kutom, a zatim dodajte izbjeljivač u boji sve dok se u vodi koja se koristi za ispiranje više ne vidi ljubičasta. To obično traje manje od 10 sekundi, pa čak i manje vremena ako izbjeljivač sadrži visoku koncentraciju acetona. Odmah prekinite ovaj korak, u suprotnom će boja također ispirati kristalno ljubičastu boju iz gram-pozitivnih i negativnih ćelija, pa se proces bojenja mora ponoviti. Višak izbjeljivača u boji odmah isperite prethodnom tehnikom.
- Čisti aceton (95%+) može se koristiti kao zamjena. Što više acetona koristite, bjelilo će brže djelovati, pa morate obratiti više pažnje na vrijeme.
- Ako imate problema s praćenjem vremena za ovaj korak, dodajte izbjeljivač boja kap po kap.
Korak 5. Posipajte kontra-boju po razmazu, a zatim isperite
Kontra mrlja, obično safranin ili fuksin, koristi se za povećanje kontrasta između gram-negativnih i gram-pozitivnih bakterija, bojenjem obezbojenih (obezbojenih) bakterija, tj. Gram-negativnih bakterija, ružičastih ili crvenih. Ostavite najmanje 45 sekundi, zatim isperite.
Fuchsin će intenzivno bojati mnoge gram-negativne bakterije, poput Haemophilus spp i Legionella spp. Ova metoda je dobra za početnike
Korak 6. Osušite stakalce
Možete ih osušiti na otvorenom da se osuše ili ih osušiti pomoću bibuloznog papira koji se prodaje u tu svrhu. Proces bojenja po Gramu je završen.
Metoda 3 od 3: Provjera rezultata bojanja
Korak 1. Pripremite svjetlosni mikroskop
Stavite pločicu pod mikroskop. Bakterije se uvelike razlikuju po veličini, pa će ukupno potrebno povećanje varirati od 400x do 1000x. Za oštriju sliku preporučuje se objektiv sa uranjajućim uljem. Ispustite ulje za potapanje na stakalce, izbjegavajući kretanje dok kaplje kako biste spriječili stvaranje mjehurića.
Uranjanje u ulje može se koristiti samo na posebno dizajniranim lećama, ne i na "suhim"
Korak 2. Pokušajte identificirati gram -pozitivne i gram -negativne bakterije
Pregledajte dijapozitiv pod svjetlosnim mikroskopom. Gram-pozitivne bakterije imaju ljubičastu boju, jer je kristalna ljubičica zarobljena unutar debele ćelijske stjenke. Gram-negativne bakterije bit će ružičaste ili crvene boje, jer se kristalno ljubičasta ispire kroz tanke ćelijske stjenke, gdje ružičasta protuboja ulazi.
- Ako je uzorak previše gust, rezultat može biti lažno pozitivan. Obojite novi uzorak ako pokazuje sve gram -pozitivne bakterije, kako biste bili sigurni da je rezultat tačan.
- Ako koristite previše izbjeljivača u boji, rezultat može biti lažno negativan. Obojite novi uzorak ako pokazuje sve gram negativne bakterije, kako biste bili sigurni da je rezultat tačan.
Korak 3. Uporedite rezultate koje vidite sa referentnom slikom
Ako ne znate kako bakterije izgledaju, proučite zbirku referentnih slika, obično razvrstanih po obliku i mrlji po Gramu. Mrežne baze podataka možete pogledati i na stranici [Nacionalna baza podataka o patogenima mikroorganizama, Bakterije u fotografijama i na mnogim drugim web stranicama. Radi lakše identifikacije, dolje su navedeni primjeri bakterija koje se često susreću ili su važne za dijagnozu, klasificirane prema njihovom statusu i obliku Grama.
Korak 4. Identificirajte gram-pozitivne bakterije na osnovu njihovog oblika
Bakterije se dalje klasificiraju prema svom obliku pod mikroskopom, najčešće kao koke (sferne) ili štapići (cilindrične). Evo nekoliko primjera gram-pozitivnih bakterija (ljubičaste boje) prema njihovom obliku:
- Gram pozitivni koki obično stafilokoki (što znači kokci grupe) ili streptokoki (što znači lančani koki).
- 'Gram pozitivne šipke kao što su Bacillus, Clostridium, Corynebacterium i Listeria. Bakterija štapića Actinomyces spp. obično imaju grane ili vlakna.
Korak 5. Identificirajte gram negativne bakterije
Gram-negativne bakterije (ružičaste boje) često se klasificiraju u tri grupe. Cocci su sfernog oblika, štapići su dugi i tanki, dok su coccoid štapići između njih.
- Gram negativni koki Najčešći je Neisseria spp.
- Gram-negativne šipke npr. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas i mnogi drugi. Vibrio cholerae se može posmatrati kao pravilna ili savijena stabljika.
- Gram-negativne "kokoidne" (ili "kokobacile") bakterije štapića na primjer Bordetella, Brucella, Haemophilus i Pasteurella
Korak 6. Pažljivo provjerite jesu li rezultati pomiješani
Neke je bakterije teško precizno obojiti zbog krtosti ili voštane prirode njihovih staničnih stijenki. Ove bakterije mogu pokazati mješavinu ljubičaste ili ružičaste boje u istoj ćeliji, ili između različitih ćelija u istom razmazu. Uzorci bakterija starijih od 24 sata mogu pokazati ovaj problem, ali postoje i neke vrste bakterija koje se i dalje teško boje u bilo kojoj dobi uzorkovanja. Ove bakterije zahtijevaju specijalizirane testove za identifikaciju, kao što je bojanje otporno na kiseline, promatranje u bakterijskoj kulturi, TSI medij za kulturu ili genetsko testiranje.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium i Propionibacterium spp. sve su gram-pozitivne bakterije, ali često nisu jasno obojene.
- Male, vitke bakterije poput Treponema, Chlamydia i Rickettsia spp. teško se mrlja po Gramovoj metodi.
Korak 7. Odložite sav preostali potrošni materijal i opremu
Ova procedura odlaganja otpada razlikuje se u laboratorijama i ovisi o korištenim materijalima. Obično se tekućina u ladici za bojenje odlaže u boce označene kao opasan otpad. Namočite stakalca u 10% rastvor izbjeljivača, a zatim ih odložite u posudu za oštre predmete.
Savjeti
- Upamtite da će rezultati bojenja po Gramu biti dobri samo ako je uzorak dobar. Važno je informirati pacijente kako bi mogli dati dobar uzorak (npr. Razlika između pljuvanja i dubokog kašlja za dobijanje uzorka sputuma).
- Kao izbjeljivač u boji, etanol reagira sporije od acetona.
- Pridržavajte se standardnih laboratorijskih propisa kako biste osigurali sigurnost.
- Za vježbanje upotrijebite bris obraza, jer sadrži i gram-pozitivne i gram-negativne bakterije. Ako vidite samo jednu vrstu bakterija, možda koristite premalo ili previše izbjeljivača.
- Za pričvršćivanje klizača možete koristiti drvene kopče.
Upozorenje
- Aceton i etanol su zapaljive tvari. Aceton će ukloniti ulje s vaših ruku, što će vašoj koži olakšati upijanje drugih kemikalija. Nosite rukavice i pažljivo ih koristite.
- Ne dopustite da se razmaz osuši prije nego što isperete gram ili kontra mrlju.
Sta ti treba
- Uzorak mreže
- Stakleni tobogan
- Pipette
- Mali izvor vatre, ili klizni grijač, ili metanol
- Voda
- Crystal violet
- Jod
- Izbjeljivač u boji, poput alkohola ili acetona
- Safranin
